美国红枫褐斑病病原菌鉴定
崔朝宇, 王园秀, 蒋军喜, 欧阳慧, 秦双林, 黄婷
林业科学. 2015, 51(10):
142-147.
doi:10.11707/j.1001-7488.20151018
摘要
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多维度评价
[目的] 鉴定江西省鄱阳县美国红枫褐斑病的病原,为该病害的防治和进一步研究奠定基础。[方法] 实地调查该病害的发生时期和为害程度,对病害症状进行观察记载。随机采集30份不同发病阶段的病叶样品,采用PDA培养基按照常规组织分离法对其进行病菌分离和菌种纯化。选择代表性菌株PM-1和PM-2作为供试菌株,用浓度为1×106个·mL-1的孢子悬浮液对美国红枫健康叶片进行刺伤接种,并对接种发病后病斑进行病菌再分离,以完成柯赫氏法则验证。将各分离菌株接种于PDA平板中央,于25 ℃黑暗条件下培养,逐日观察测量菌落大小、颜色、形状、质地及产孢情况等性状。对自然发病寄主上着生的病菌和人工培养的病菌分别制作切片,在显微镜下观察载孢体及分生孢子形态,并测量其大小。根据培养菌落形态特征和病菌形态大小,参考相关文献,对病原菌进行种类归属鉴定。提取病菌基因组DNA,采用真核生物核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')对病菌ITS-5.8S rDNA区段进行PCR扩增和序列测定。使用BLAST工具软件,在GenBank中进行序列同源性搜索,并利用MegA 5.2软件中的邻位加入法构建系统发育树,以对病菌进行分子鉴定。[结果] 美国红枫褐斑病只为害叶片,5月中旬始发,6月中下旬进入盛发期,重病株发病率达60%以上。病斑常呈圆形、椭圆形或不规则形,中央黄褐色,边缘黑褐色,周围有黄色晕圈,后期病斑常联合成大斑,造成叶片大面积枯死而脱落。在潮湿条件下,在病斑上常形成黑色小点,为病菌的分生孢子盘和分生孢子。共分离获得25个培养性状一致的真菌菌株,菌落正面白色,绒状,平铺,背面淡黄色。分离菌株具有致病性,人工接种发病症状与自然发病症状相同。病菌载孢体为分生孢子盘,直径108~205 μm; 分生孢子纺锤形,直或微弯,5个细胞,大小(19.3~26.8) μm×(5.3~6.8) μm; 中间3个细胞褐色,长11.9~17.0 μm; 顶细胞长圆锥形,顶生2~4根不分枝的附属丝,无色透明,长6.3~18.3 μm; 基细胞无色,具短柄,长1.8~7.5 μm。病菌ITS-rDNA序列长606 nt,与GenBank中小孢拟盘多毛孢的序列同源性为100%,在系统发育树上,与小孢拟盘多毛孢的亲缘关系也最近。[结论] 形态学和分子生物学鉴定结果表明,引起江西省鄱阳县美国红枫褐斑病的病原菌为小孢拟盘多毛孢,属于子囊菌无性型拟盘多毛孢属真菌。