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林木育种

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农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系     刘闵豪,徐郡儡,叶靖,李周岐,范睿深,李龙 林业科学   2020,56(2 ):79 -88. DOI:10.11707/j.1001-7488.20200209 摘要  （569） HTML （20） PDF（pc） （2588KB）（462） 收藏 目的: 优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系，研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性，探索影响农杆菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平，构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系，使杜仲成年植株外植体为受体的遗传转化成为可能，为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础。方法: 以杜仲成年植株叶片为材料诱导愈伤组织，通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖，确定最适培养基。在此基础上，在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂，研究愈伤组织对其敏感性。以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础，通过L16（45）的正交试验，探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化的瞬时转化效率的影响，建立最适瞬时转化体系。使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作，筛选抗性芽，对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验。结果: 再生体系优化的结果表明，3/4大量元素浓度的MS培养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长；愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0.27 μmol·L-1 NAA+4.4 μmol·L-1 6-BA，诱导率为83%±10.0%；不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0.054 μmol·L-1 NAA+4.4 μmol·L-1 6-BA，平均伸长长度为（2.47±1.33）cm。抗生素与抑菌剂敏感性试验表明，遗传转化的选择培养基中，抑菌剂头孢霉素的最适浓度为200 mg·L-1，筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg·L-1。转化因子的正交试验表明，最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为：预培养5天、侵染10 min和共培养3天。使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作，共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽；GUS组织化学染色显示GUS基因在抗性芽中得到了表达，PCR检测证明这些抗性芽中存在NPTⅡ基因。结论: 杜仲叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0.27 μmol·L-1 NAA+4.4 μmol·L-1 6-BA，不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0.054 μmol·L-1 NAA+4.4 μmol·L-1 6-BA。农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为：预培养5天、侵染10 min和共培养3天，筛选培养基为3/4MS+0.054 μmol·L-1 NAA+4.4 μmol·L-1 6-BA+200 mg·L-1 Cef+70 mg·L-1 Km。利用此体系共获得3个抗性芽，PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价

马尾松转录组密码子使用偏好性及其影响因素     朱沛煌,陈妤,朱灵芝,李荣,季孔庶 林业科学   2020,56(4 ):74 -81. DOI:10.11707/j.1001-7488.20200408 摘要  （228） HTML （13） PDF（pc） （2310KB）（355） 收藏 目的: 异源表达是植物蛋白功能验证和分子育种的重要手段，而密码子是异源基因高效表达的重要因素，对马尾松转录组基因编码区密码子偏好性分析可以为马尾松分子育种提供一定的理论支持。方法: 利用CodonW、EMBOSS密码子分析软件对马尾松转录组进行密码子参数分析和密码子偏好性分析，根据中性绘图、ENc-GC3s、偏倚性分析推测马尾松密码子偏好性的主要形成原因。通过比较高低表达基因样本同义密码子相对使用度（RSCU）筛选马尾松最优密码子，通过密码子使用频率比值分析马尾松与拟南芥、烟草、欧洲山杨、大肠杆菌、酿酒酵母的密码子偏好性差异。结果: 马尾松转录组编码序列（CDS）密码子平均GC含量为44.95%，密码子第3位GC含量为38.95%，尤为偏好A/T。高、低表达基因样本统计分析表明，马尾松转录组RSCU差异较小，筛选出TTA、CAA、TGT、GGT等27个密码子可作为马尾松的最优密码子。中性绘图、ENc-GC3s关联分析以及偏倚分析表明，马尾松密码子偏好性的形成可能主要受突变影响，其次受自然选择等多重因素共同影响。密码子使用频率分析表明马尾松密码子偏好性与烟草、拟南芥和欧洲山杨相比差异较小，与大肠杆菌差异最大，与酿酒酵母差异小于大肠杆菌。结论: 马尾松偏好第3位为A/T的密码子，筛选出27个最优密码子，其中25个密码子第3位为A/T。马尾松密码子使用偏好性形成主要受突变影响，其次受自然选择等多重因素共同影响。烟草可以作为马尾松基因异源表达的优选植物生物体，而微生物中酿酒酵母可能优于大肠杆菌。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价

元江箭竹花器官形态与解剖观察及其败育分析     黄玲,邓琳,初彩华,詹卉,王曙光 林业科学   2020,56(4 ):64 -73. DOI:10.11707/j.1001-7488.20200407 摘要  （263） HTML （10） PDF（pc） （6417KB）（114） 收藏 目的: 以元江箭竹花序与花器官为研究对象，进行形态解剖学观察研究，分析元江箭竹花序特征与开花特性及结实率低的原因，并试图通过组培技术改变其败育状况，为元江箭竹生殖生物学及育种工作提供新的理论数据。方法: 采用解剖观察的方法对花器官进行形态与解剖结构特征描述，运用石蜡切片对其雌、雄配子体的发育过程进行研究，采用TTC染色法测定花粉活力，并对野外与组培条件下花药的发育情况进行比较与分析。结果: 江箭竹花序顶生，偶具侧生，花序具总柄，由1片营养叶包裹。整个花序为单轴分枝，顶部小穗发育早于基部小穗，为有限花序，单个小穗基部小花先开放，因此属无限花序。每个小穗含4~5朵小花，小花均长0.9 cm，小花间由小穗轴相连，小穗轴顶端膨大具白色绒毛。小穗基部具颖片2枚；内、外稃对生，各1片；浆片3枚；雌蕊1枚；雄蕊3枚。浆片位于内稃与雄蕊之间，小花发育成熟，浆片吸水膨胀，花药伸出，花药为淡黄绿色或紫红色，花药具4室。未成熟花药壁从外向内依次由表皮、药室内壁、中层和绒毡层4层细胞组成。花药发育至二分体时期，绒毡层开始退化，绒毡层细胞属于腺质型。成熟花粉粒为二细胞型，花粉粒平均直径为43.92 μm，被TTC染成红色，活力为54.78%，但萌发率极低，甚至不萌发，花粉败育，其败育方式可总结为绒毡层过度发育、花药壁皱缩、花粉粒退化、空壳花粉粒4种类型。子房为2心皮1室，侧膜胎座，倒生胚珠，双珠被，柱头2裂呈羽毛状，短花柱长柱头型，雌雄同熟、异位。组培条件下，花芽可正常发育成小穗并开花，内外稃张开花药伸出小穗外。花药壁纤维层加厚明显，呈连续性，但多数花粉粒仍出现空壳现象。结论: 元江箭竹为混合花序，单轴分枝，开放型风媒花。元江箭竹属于典型的雄性不育，无法形成有效花粉是导致元江箭竹结实率低的主要原因。元江箭竹花芽在组培条件下可继续开花，花药伸出小穗外，但花粉发育仍然异常，通过组培技术无法改变其败育现象，说明元江箭竹的雄蕊败育可能并非养分不足造成的。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价

‘冷白玉’枣果实发育过程中内源激素变化与胚败育的关系     任海燕,王永康,赵爱玲,薛晓芳,弓桂花,杜学梅,李登科,杜俊杰 林业科学   2020,56(4 ):55 -63. DOI:10.11707/j.1001-7488.20200406 摘要  （348） HTML （6） PDF（pc） （2638KB）（113） 收藏 目的: 生长素、赤霉素、脱落酸等植物内源激素在促进胚胎发育过程中起着重要的作用。本研究通过分析‘冷白玉’枣4个重要发育阶段胚胎和果肉中生长素（IAA）、赤霉素（GA4）、顺式脱落酸（cABA）和反式脱落酸（tABA）的动态变化，探究枣胚败育与果实发育过程中内源激素变化的相互关系，为阐明枣胚败育机理提供证据，为败育胚的挽救提供理论支撑。方法: 以处于原胚、小球形胚、球形胚、鱼雷形胚4个时期的‘冷白玉’枣为试材，监测幼果和幼胚发育状况，采用液相色谱-质谱检测枣果发育过程中正常胚、败育胚、胚正常果肉、胚败育果肉中IAA、GA4、cABA、tABA 4种内源激素含量的变化。结果: 1）胚中IAA的含量显著高于果肉。在胚中，正常胚中IAA含量呈逐渐升高趋势，而在败育胚中IAA含量呈逐渐下降趋势。胚正常果肉中IAA含量变化呈倒V字形，而胚败育果肉中呈正V字形。2）胚中GA4的含量明显低于果肉，并一直处于较低水平。正常胚中GA4含量低于败育胚。胚发育正常果肉和胚败育果肉中GA4含量均表现为先升高后降低的趋势。3）cABA在果肉和胚发育过程中均表现为逐渐降低趋势。在正常胚中，cABA含量大于果肉中的含量；败育胚中，cABA含量小于果肉中的含量。4）胚中tABA的含量高于果肉。在胚中，正常胚中tABA的含量呈逐渐下降趋势，而在败育胚中tABA呈逐渐上升趋势，并在后期高于正常胚。在果肉中，胚正常果肉和胚败育果肉中的tABA含量均呈先下降后缓慢升高趋势。5）胚中低水平的GA4且较高水平的IAA，及后期低含量的tABA、cABA和较高的IAA/GA4比值有利于幼胚的正常发育。胚中IAA下降和tABA增加及（GA4+IAA）/ABA比值下降是导致胚败育的重要因素。结论: 在枣幼胚发育前期，需要较高的生长类激素促进生长，而在发育后期胚中tABA含量的增加可引起胚败育。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价

矮牡丹与芍药属其他5个种叶绿体基因组特征的比较     周晓君,张凯,彭正锋,孙姗姗,押辉远,张延召,程彦伟 林业科学   2020,56(4 ):82 -88. DOI:10.11707/j.1001-7488.20200409 摘要  （300） HTML （7） PDF（pc） （1921KB）（284） 收藏 目的: 中国特有的野生牡丹一直被国内外视为珍贵的种质资源。野生矮牡丹被认为是现代栽培牡丹品种重要的祖先种之一，开展矮牡丹在内的芍药属植物叶绿体基因组（cp DNA）特征分析对阐明牡丹系统进化、培育和改良栽培品种具有重要的理论与实践价值。方法: 在矮牡丹叶绿体高通量测序的基础上，从NCBI数据库下载凤丹牡丹、大花黄牡丹、滇牡丹、川赤芍和草芍药的cp DNA数据，利用Geneious 8.0、EMBOSS 6.4.0等软件，对芍药属6个种的cp DNA进行对比分析。结果: 矮牡丹cp DNA序列共152 628 bp，共有112个基因，使用25 988个密码子，编码蛋白78个；有19个基因（包括4个rRNA、7个tRNA、8个蛋白编码基因）在IR（反向重复）区重复。共搜索到143个SSR位点，单核苷酸重复基序位点最多，为116个（占81.12%），没有六核苷酸重复基序。尽管芍药属叶绿体基因组比较保守，但不同种间IR和LSC（大单拷贝区）的边界位置仍有一定变化，凤丹牡丹LSC/IR的rpl2基因有718 bp延伸至LSC区域，而其他种的rpl2基因均完整地位于IR区。结论: 从基因组大小和基因内容来看，芍药属cp DNA高度保守；草芍药与滇牡丹cp DNA最大，为152 698 bp；凤丹牡丹cp DNA最小，为152 153 bp。矮牡丹cp DNA蛋白编码基因密码子偏好使用A/T碱基，SSRs位点的碱基组成也偏好使用A/T碱基，143个SSRs位点中，A/T组成的位点有134个；矮牡丹cp DNA SSRs分布具有不均匀性，14个SSR位点位于IR区段，103个位于LSC区段，26个位于SSC区段。IR边界分析显示，芍药属LSC/IRb的边界变化是IR区扩张与收缩的主要原因。研究结果为芍药属植物的系统进化与栽培起源等研究提供支持，对芍药属植物分子标记开发及优良品种选育具有参考价值。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价

白桦HSFA4转录因子的克隆及耐盐功能分析     刘中原,刘峥,徐颖,刘珊珊,田志兰,解庆军,高彩球 林业科学   2020,56(5 ):69 -79. DOI:10.11707/j.1001-7488.20200508 摘要  （419） HTML （20） PDF（pc） （5330KB）（241） 收藏 目的: 热激转录因子（HSF）在植物对非生物胁迫应答中起重要的调节作用。本研究拟从白桦中克隆获得HSFA4基因（命名为BpHSFA4），研究该基因的抗逆功能，为该基因用于林木基因工程育种奠定理论基础。方法: 在白桦转录组中筛选获得1条HSFA4基因，通过RT-PCR克隆获得BpHSFA4基因序列。利用生物信息学工具进行序列分析。利用实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析不同逆境胁迫下BpHSFA4基因在白桦叶、茎和根中的表达模式。构建植物过表达载体pROKⅡ-BpHSFA4和抑制表达载体pFGC5941-BpHSFA4，进行白桦瞬时转化，同时以pROKⅡ瞬时侵染白桦作为对照。分析NaCl胁迫下不同瞬时转化白桦株系的MDA、H2O2、SOD、POD、相对电导率及二氨基联苯胺（DAB）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）及伊文思蓝（Evans blue）染色情况，以综合评定BpHSFA4基因的耐盐功能。结果: BpHSFA4基因cDNA全长为1 170 bp，编码389个氨基酸，编码蛋白的相对分子量为44.15 kDa，理论等电点为5.14，具有典型HSF结构域。非生物胁迫（NaCl、PEG6000、镉、高温和低温）条件下和激素（ABA、GA3和JA）处理下，BpHSFA4基因的表达均发生了不同程度的改变，且每种处理后至少有1个时间点发生了明显上调或者下调，其中盐胁迫下表达变化尤为明显。3种瞬时表达白桦株系中的BpHSFA4基因的表达分析结果显示成功获得了瞬时过表达转基因株系（OE）和抑制表达转基因株系（SE）。进一步对不同转基因白桦株系的生理指标和生理染色进行分析，结果显示：NaCl胁迫条件下，过表达BpHSFA4植株H2O2含量、MDA含量和相对电导率明显低于对照植株，抑制表达BpHSFA4植株的H2O2含量、MDA含量和相对电导率则明显高于对照植株；过表达BpHSFA4植株的SOD活性和POD活性明显高于对照植株，而抑制表达BpHSFA4植株的SOD活性和POD活性明显低于对照株系；NBT、DAB染色结果与H2O2含量测定结果一致，显示OE植株的着色明显比对照植株浅，而抑制表达株系着色明显比对照植株深，Evans blue染色结果和MDA含量测定结果一致。结论: BpHSFA4基因能对非生物胁迫（NaCl、PEG6000、镉、高温和低温）和激素（ABA、GA3和JA）处理做出应答，特别是盐胁迫条件下，应答强烈，该基因可能参与白桦耐盐胁迫应答。在盐胁迫条件下，瞬时过表达BpHSFA4基因株系能通过提高SOD和POD等保护酶的活性从而增强活性氧清除能力、降低膜脂氧化程度，减少细胞受损或细胞死亡，进而提高白桦的耐盐能力。本研究初步证实BpHSFA4基因是一个耐盐胁迫应答候选基因。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价

多脉铁木叶绿体基因组的序列特征和系统发育     蒋明,柯世省,王军峰 林业科学   2020,56(5 ):60 -68. DOI:10.11707/j.1001-7488.20200507 摘要  （293） HTML （10） PDF（pc） （3561KB）（232） 收藏 目的: 多脉铁木是中国特有种，为浙江省珍稀濒危野生植物和极小种群保护对象。在浙江，多脉铁木的野生植株数量极其稀少，低龄个体极少，种群面临衰退。叶绿体基因组在进化过程中相对保守，可为亲缘关系分析和系统发育研究提供有用信息。本研究在组装叶绿体基因组的基础上，对序列特征进行分析，以明确多脉铁木叶绿体基因组的大小、结构和基因组成等信息；通过系统发育分析，明确其与近缘种的关系和分类地位。方法: 利用CTAB法提取多脉铁木的基因组DNA，并构建测序文库，用HiSeq X Ten进行高通量测序，策略为双端测序；借助NovoPlasty组装叶绿体基因组；用PCR方法克隆边界序列并进行测序验证；SSR的检测采用MISA软件；利用PhyML 3.0构建系统发育树。结果: 去除接头和低质量的序列，共得到19 869 412条clean reads。序列组装结果表明，多脉铁木叶绿体基因组的全长为159 583 bp，具一个典型的四分体结构，大单拷贝区、小单拷贝区及反向重复序列的长度分别为88 514、18 953、26 058 bp。多脉铁木叶绿体基因组中共有131个基因，其中蛋白编码基因85个、tRNA基因36个、rRNA基因8个，其中的ycf1和ycf15为假基因，它们的序列长度均短于正常基因。多脉铁木叶绿体基因组上共有58个SSR，其中单碱基重复有53个。序列比对结果表明，多脉铁木与天目铁木的相似性最高，达99.1%，与铁木的相似性最低，为98.7%。构建系统发育树的最佳模型为GTR+G+I，其中的AIC（赤池信息标准）和BIC（贝叶斯信息标准）分别为556 643.629 64和556 954.642 07。系统发育分析结果表明，12种植物在发育树上可分为两大组，桦木族的日本桤木和红桤木聚为一组，榛族的10种植物聚于另一组；多脉铁木与铁木属其他3个种聚于同一分支，支持率均为100%。结论: 在高通量测序的基础上，组装完成多脉铁木的叶绿体基因组，它与天目铁木、毛果铁木和铁木叶绿体基因组的相似性较高，在系统发育树上聚为一组。多脉铁木叶绿体基因组的组装、序列比对和系统发育分析，可为后续开展遗传结构和群体遗传多样性研究奠定基础。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价