蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达*

doi:10.11707/j.1001-7488.20091206

林业科学 ›› 2009, Vol. 12 ›› Issue (12): 36-41.doi: 10.11707/j.1001-7488.20091206

蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达*

谢树章^1,2 秦平伟¹ 张迷¹ 胡雨晴¹ 李名扬¹ 眭顺照¹

1. 西南大学园艺园林学院重庆市花卉工程技术研究中心重庆400715； 2. 重庆市农业科学院生物技术研究中心重庆400055

收稿日期:2009-02-26 修回日期:1900-01-01 出版日期:2009-12-25 发布日期:2009-12-25
通讯作者: 眭顺照
基金资助:

Cloning and Prokaryotic Expression of a Chitinase cDNA from Chimonanthus praecox

Xie Shuzhang^1,2,in Pingwei¹,Zhang Mi¹,Hu Yuqing¹,Li Mingyang¹,Sui hunzhao¹

1. Chongqing Flower Engineering Technology Research Center College of Horticulture and Landscape， Southwest University Chongqing 400715;2. Biotechnology Research Center, Chongqing Academy of Agricultural Sciences Chongqing 400055

Received:2009-02-26 Revised:1900-01-01 Online:2009-12-25 Published:2009-12-25
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摘要/Abstract

摘要：

在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上，通过随机克隆测序，得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia (GenBank登录号:FJ749130)。Cpchia cDNA全长为1 184 bp，开放阅读框为954 bp，编码317个氨基酸，其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区，无C端延伸区，为Class Ⅰb型胞外几丁质酶，属于几丁质酶第19家族。将Cpchia 克隆到原核表达载体pET-28a(+)，在大肠杆菌BL2l细胞中以包涵体形式表达融合蛋白，利用透析法获得复性蛋白，其几丁质酶活性经DNS法检测达到200 U·mL^-1。酶活性和稳定性分析表明，试验条件下，pH 7.0有利于酶的稳定和活性发挥，40 ℃活性最高，在0 ℃低温下也有较高活性。上述结果说明,分离的Cpchia基因编码蛋白具有几丁质酶活性，而且可能与蜡梅花的抗寒性形成有关。

关键词: 几丁质酶, 克隆, 原核表达, 蜡梅

Abstract:

A chitinase gene was isolated based on the library construction from Chimonanthus praecox flower and its EST analysis, and was named as Cpchia (GenBank accession No. FJ749130). The full length of Cpchia sequence was 1 184 bp, containing an opening reading frame of 954　bp. It encoded a polypeptide of 317 amino acid residues including signal peptide, cysteine-rich domain, hinge region, and catalytic domain. The homogeneity in structure and sequence showed that this cDNA would belong to Class Ⅰb chitinase, a member of the 19th chitinase family. We inserted this gene into the prokaryotic expression vector of pET-28a(+) and it expressed in Escherichia coli BL2l as inclusion bodies. The refolded proteins were obtained after stepwise dialysis, and the highest activity was 200 U·mL^-1 measured with 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method. The enzyme was stable at pH 7.0， and had the most activity at 40 ℃ and remained active at 0 ℃. The results showed that Cpchia encoded the protein with chitinase activity and probably was related to cold tolerance of Chimonanthus praecox blooming.

Key words: chitinase, cloning, prokaryotic expression, Chimonanthus praecox

中图分类号:

谢树章;秦平伟张迷胡雨晴李名扬眭顺照. 蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达*[J]. 林业科学, 2009, 12(12): 36-41.

Xie Shuzhang;in Pingwei;Zhang Mi;Hu Yuqing;Li Mingyang;Sui hunzhao. Cloning and Prokaryotic Expression of a Chitinase cDNA from Chimonanthus praecox[J]. Scientia Silvae Sinicae, 2009, 12(12): 36-41.

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