林业科学 ›› 2003, Vol. 39 ›› Issue (3): 53-62.doi: 10.11707/j.1001-7488.20030309
DietrichEwald 胡建军
Dietrich Ewald,Hu Jianjun
摘要：
本文报道了挪威云杉(Picea abies)和杂种落叶松(Larix deciduas×L. kaempferi)人工授粉种子诱导胚性细胞系及植株的再生。挪威云杉在德国Saxon Ore山区被选为对空气污染有抗性的树种并种植在位于Waldsieversdorf的林木遗传育种研究所的种植园中。对挪威云杉测试了几个不同亲本组合的种子形成胚性细胞系的能力。这些云杉种子于1992-01采收,含有干燥的成熟合子胚。作为对照,相同的亲本组合云杉种子于1993-08和1998-08采收,合子胚处于成熟中。杂种落叶松则只有一个人工授粉组合,大田试验证实幼苗生长良好。分别于1995和1996年采收含有未成熟合子胚的未成熟种子。诱导愈伤形成用附加细胞分裂素(激动素和 或BAP)和生长素(NAA ,2 ,4-D)及有机氮源(水解酪蛋白和谷氨酰胺)的标准培养基(SPE和MSG) ,于黑暗下培养。尽管在建立培养体系后5～12周产生了大量胚性愈伤组织,诱导率超过25% ,但1a后只有超过1%的胚性愈伤组织稳定生长。挪威云杉稳定胚性细胞系的数量与成熟合子胚的采收季节及建立细胞系的时间(8月或1月)无关,但在8月收获的合子胚在挪威云杉5～12周后胚性愈伤组织诱导率要高些,然而能在悬浮培养中生长及随后成熟体胚能顺利再生植株的稳定胚性细胞系的数量有限。挪威云杉体胚未充分发育的根影响其移栽到土壤中的成活率。在建立的12个细胞系中只有一个在干燥保存后能从体胚再生正常植株。同时考察了影响挪威云杉形成成熟体胚的因素,如用PEG4 000 (7.5% )及ABA[8mg·L-1(30.26μmol)-1]处理及ABA灭菌方式(高温高压灭菌或过滤灭菌)对成熟体胚形成的影响。总体来说,过滤灭菌的ABA增加了成熟体胚的数量。营养培养基中用淀粉部分取代蔗糖只导致2个细胞系中的一个增加了成熟体胚的数量。1995和1996年对人工授粉杂种落叶松合子胚发育与自然授粉(不套授粉袋)的相比较,发现人工授粉袋的使用延迟了合子胚的发育。我们的实验中成熟合子胚没有形成胚性细胞系,只有未成熟合子胚形成了胚性细胞系。1995年用落叶松未成熟合子胚建立的胚性细胞系没有形成体胚,而1996年建立的4个胚性细胞系得到了可以移栽到温室中的再生植株。15a的连续继代培养以后,大多数的杂种落叶松和挪威云杉的胚性细胞系的再生能力都下降。导致这种现象可能有多种原因包括培养物的老化以及出现难以检测到的内生细菌。尽管一组实验从最初培养即用了抗生素,但没有收效。因此目前只得到少量的稳定胚性细胞系(<5%) ,长期继代后丧失再生能力及无法成功移栽到土壤都是植株再生的重要的限制因素,有待进一步研究克服这些困难。
