目的: 探究林窗大小和土层深度对马尾松次生林土壤理化性质、胞外酶活性及微生物代谢策略的交互影响,阐明林窗扰动下马尾松次生林土壤养分循环的土层分异规律,明确驱动土壤胞外酶活性及微生物代谢策略变化的关键环境因子。方法: 以湖南省慈利县天心阁林场退化马尾松次生林为研究对象,2018年12月,采用随机区组设计,按照无林窗对照(CK)、小林窗(S,68~75 m2)、中林窗(M,180~190 m2)和大林窗(L,445~480 m2)4种梯度设置4个区组。2024年5月,在各处理样地随机设置5个2 m×2 m样方,按0~2、2~5、5~10和10~20 cm土层分别采集枯落物和土壤样品,测定枯落物指标、土壤理化性质以及土壤胞外酶β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)、纤维二糖水解酶(CBH)、乙酰葡糖胺糖苷酶(NAG)、酸性磷酸酶(ACP)活性。结合酶化学计量学与向量分析(向量长度,VL;向量角度,VA),利用双因素方差分析,评估林窗大小和土层深度对马尾松次生林土壤理化性质、胞外酶活性及微生物代谢策略的交互效应;通过冗余分析(RDA)和偏最小二乘法结构方程模型(PLS-SEM),识别土壤酶活性及其计量比变化的关键环境驱动因子。结果: 1) 与对照相比,中林窗可显著提高土壤pH值、含水量和无机氮含量;林窗大小和土层深度对土壤有机碳含量、全氮含量和矿物结合态有机碳含量的影响存在显著交互效应,且该交互效应随土层加深而减弱。2) 土壤酶活性的林窗响应呈现随土层加深而减弱的特征。林窗效应主要集中于0~10 cm土层,中林窗可显著提升CBH和ACP活性,但中林窗的促进作用在10~20 cm土层显著减弱。3) 研究区土壤微生物代谢普遍受磷限制(VA>45°),大林窗显著加剧微生物碳资源限制,表现为酶化学计量碳氮比(EC∶N)和向量长度(VL)显著升高,且磷限制程度随土层加深而增强。4) 土壤含水量是驱动酶活性空间变异的主导因子,土壤碳氮比是调控酶化学计量特征和微生物资源分配策略的关键因素。5) 结构方程模型显示,林窗大小和土层深度通过调控枯落物输入和土壤养分的垂直分布,导致土壤酶活性及其计量特征改变,进而影响微生物的碳、磷限制程度。结论: 林窗可显著改善马尾松次生林0~10 cm土层土壤微环境,进而影响土壤胞外酶活性及微生物代谢策略,其影响随土层加深逐渐减弱;中林窗是改善马尾松次生林土壤水分、氮素供应和促进土壤胞外酶活性的最优尺度,大林窗会加剧微生物资源胁迫;研究区土壤微生物普遍受磷限制,且土层深度越深土壤磷限制越强;土壤水分和土壤碳氮比是影响胞外酶活性及微生物代谢策略变化的关键环境因子。在森林经营与生态修复中,合理调控林窗大小可缓解微生物养分胁迫,有效提升退化马尾松林地下生态系统功能。